BỐN YẾU TỐ ĐẾM TẾ BÀO CHÍNH XÁC

Hầu hết các ứng dụng phân tích tế bào sử dụng trong nghiên cứu cũng như trị liệu đều đòi hỏi biết chính xác số lượng tế bào trong mẫu. Để xác định con số này, các nhà nghiên cứu thường sử dụng một trong hai phương pháp bao gồm phương pháp thủ công, quan sát và đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, và phương pháp sử dụng một máy đếm tế bào như Countess 3/3 FL.

Đếm tế bào buồng đếm hồng cầu là phương pháp truyền thống, tuy nhiên phương pháp khó lặp lại kết quả đếm. Thông thường, sai số giữa 2 kỹ thuật viên khi đếm cùng một mẫu tế bào sẽ lớn hơn 20%. Một trong những phương pháp để giải quyết sai số lớn của việc đếm thủ công là sử dụng một máy đếm tế bào. Một máy đếm tế bào đáng tin cậy như Countess 3 FL sẽ có sai số rất thấp, dưới 5%, gia tăng độ lặp lại của các thí nghiệm.

Việc sử dụng các máy đếm tế bào tự động là một giải pháp giúp hạn chế sai số chủ quan của người dùng và tiết kiệm thời gian cho các thí nghiệm nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, để có thể đạt được một kết quả đếm tế bào chính xác, có khả năng lặp lại, chúng ta cần quan tâm đến 4 yếu tố quan trọng gồm:

- Quy trình chuẩn bị mẫu

- Lựa chọn mặt phẳng tiêu cự phù hợp.

- Điều chính chế độ ánh sáng phù hợp.

- Thiết lập được các tiêu chí phù hợp để đếm tế bào muc tiêu.

1. Quy trình chuẩn bị mẫu

Quy trình chuẩn bị mẫu là yếu tố quan trọng hàng đầu cho việc đếm chính xác tế bào. Một quy trình chuẩn bị mẫu hiệu quả và thống nhất sẽ mang lại các kết quả ổn định và đáng tin cậy.

Để có một quy trình đếm tế bào hiệu quả người dùng cần chú ý các vấn đề gồm:

1. Đảm bảo nuôi cấy tế bào trong điều kiện tiêu chuẩn: Điều kiện nuôi cấy tế bào tiêu chuẩn sẽ hạn chế các tác động không thể kiểm soát được của hóa chất, quá trình thao tác với pipet hoặc máy ly tâm
2. Đảm bảo mẫu tế bào dùng để đếm bằng máy đếm tế bào ở dạng huyền phù và được đồng nhất: Mẫu nên được vortex nhẹ trước khi đưa lên slide để tránh hiện tượng lắng của tế bào trong ống.
3. Hạn chế tạo các mảnh vỡ tế bào: các mảnh vỡ tế bào thường có kích thước không đồng nhất và là yếu tố quan trọng tạo nên sai số của các lần đếm. Đế hạn chế các mảnh vỡ tế bào người dùng nên sử dụng các thuốc nhuộm mới, không lắng cặn, môi trường và hóa chất nuôi cấy ở được lọc vô trùng, cấy chuyền tế bào đúng thời điểm

2. Lựa chọn mặt phẳng tiêu cự phù hợp

Lựa chọn mặt phẳng tiêu cự là yếu tố quan trọng thứ hai để có được kết quả đếm tế bào chính xác, đặc biệt trong việc xác định tỉ lệ tế bào sống/chết. Tuy nhiên, với việc đếm thủ công, việc lựa chọn mặt phẳng tiêu cự là nguyên nhân quan trọng nhất tạo nên khác biệt lớn về kết quả giữa những người thao tác. Một mặt phẳng tiêu cự đúng sẽ cho chất lượng hình ảnh tốt, người đọc hoặc máy đếm tế bào dễ dàng phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, ngược lại một mặt phẳng tiêu cự không đúng hình ảnh của các tế bào sống thường dễ bị nhận dạng nhầm là tế bào chết (hình 1).

Hình 1: Mặt phẳng tiêu cự đúng (A), không đúng (B)

Hiện nay, nhiều máy đếm tế bào tự động như Countess 3 FL có tính năng tự động lấy nét (autofocus) dựa trên thuật toán Machine Learning. Nếu người đếm thủ công chỉ có thể quét qua một vài mặt phẳng tiêu cự trước khi chọn được đúng mặt phẳng tiêu cự tốt nhất cho mắt, thì máy đếm tế bào tự động Countess 3 FL có thể phân tích trên 30 mặt phẳng tiêu cự này trong 15 giây, và đếm trên những mặt phẳng tiêu cự có độ tương phản tốt nhất.

Như vậy, trước khi lựa chọn một máy đếm tế bào tự động, chúng ta cần chú ý đến khả năng chọn mặt phẳng tiêu cự của máy, việc đếm chỉ diễn ra chính xác trên một mặt phẳng tiêu cự có chất lượng hình ảnh tốt nhất.

3. Điều chính chế độ ánh sáng phù hợp

a. Cường độ ánh sáng trắng: Hầu hết các nhà nghiên cứu sẽ sử dụng thuốc nhuộm Trypan Blue để đếm và xác định tỉ lệ sống chết của mẫu tế bào. Nếu tế bào chết Trypan blue sẽ xâm nhập tế bào và nhuộm DNA trong nhân tế bào thành màu xanh đậm. Ngược lại, khi tế bào sống Trypan Blue không thể xâm nhập tế bào để nhuộm DNA. Do đó, cường độ ảnh sáng quá cao hoặc quá thấp sẽ là nguyên nhân dẫn đến xác định sai tỉ lệ sống chết của tế bào (hình 2).

Máy đếm tế bào tự động Countess 3 FL có hai đặc tính bao gồm sử dụng nguồn đèn LED có cường tính ổn định cao đi cùng khả năng tự động điều chỉnh độ sáng giúp hệ thống gần như loại bỏ hoàn toàn sai số do cường độ ánh sáng không phù hợp.

Hình 2: Cường độ sáng được tiêu chỉnh quá cao (A) hoặc quá thấp (B)

Một yếu tố tạo nên sự khác biệt của một máy đếm tế bào đáng tin cậy là khả năng đếm tế bào mục tiêu trong một quần thể không đồng nhất. Ở một số loại mẫu không đồng nhất tình trạng các tín hiệu nền hoặc các mãnh vỡ tế bào xuất hiện rất nhiều, ảnh hưởng lớn đến kết quả đếm.

Do đó, trong các trường hợp này một máy đếm tế bào có khả năng phân tích tín hiệu huỳnh quang đi cùng với các chất nhuộm huỳnh quang có khả năng nhuộm chính xác tế bào mục tiêu là một đặc tính quý báu giúp người dùng hoàn toàn yên tâm về kết quả đếm (hình 3).

Countess 3 FL có 2 vị trí gắn nguồn đèn và filter huỳnh quang, phù hợp sử dụng 20 nguồn đèn huỳnh quang khác nhau, đáp ứng với hầu hết chất nhuộm huỳnh quang trên thị trường. Khác với một số máy đếm tế bào khác không cho phép thay thế các nguồn đèn này, người sử dụng máy đếm tế bào Countess 3 FL hoàn toàn tự thay thế các nguồn đèn huỳnh quang của máy mà không cần các phương pháp hiệu chuẩn phức tạp.

Hình 3: Khả năng đếm tế bào trên 2 kênh huỳnh quang của máy đếm tế bào tự động Countess II FL

4. Thiết lập được các thông số phù hợp để đếm tế bào mục tiêu.

Một ưu điểm vượt trội quan trọng của máy đếm tế bào tự động so với việc đếm thủ công là khả năng thiết lập các thông số khác nhau để thực hiện đếm tế bào chính xác. Đối với phương pháp đếm thủ công, các thông số đếm phụ thuộc vào người quan sát, và hiếm khi thống nhất giữa các lần đếm.

Với máy đếm tế bào tự động Countess 3 FL, người dùng dễ dàng thiết lập bộ thông số đếm cho riêng mình, chỉ cần thao tác theo HDSD của máy. Countess 3 FL cung cấp một bộ tiêu chí bao gồm: độ tròn của tế bào (Circularity), kích thước (cell size), độ sáng (brightness) và cường độ huỳnh quang (fluorescence intensity). Mỗi thông số cung cấp một khoảng giá trị giúp người dùng dễ dàng điều chỉnh. Bộ thông số sau khi điều chỉnh được lưu trữ và dễ dàng sử dụng ở các lần đếm sau đảm bảo sự lặp lại của kết quả đếm tế bào (hình 4).

Hình 4. Giao diện điều chỉnh thông số thân thiện của máy đếm tế bào tự động Countess 3 FL

1. Độ tròn của tế bào: Các mảnh vỡ tế bào thường xuất hiện trong các nền mẫu khó như mẫu máu hoặc mẫu môi trường nuôi cấy cũ. Các mảnh vỡ này hầu hết không có hình dạng không xác định, do đó dễ dàng loại bỏ khi điều chỉnh thông số độ tròn
2. Kích thước: Việc giới hạn kích thước tế bào là đặc tính quan trọng giúp máy đếm tế bào chọn lựa được các tế bào mục tiêu. Khác với những hệ thông khác, máy đếm tế bào tự động Countess 3 FL cung cấp khả năng điều chỉnh kích thước tế bào sống và tế bào chết độc lập. Điều này tạo nên sự linh hoạt lớn nhằm giúp người dùng dễ dàng điều chỉnh để có kết quả đếm chính xác. Thông thường, hai thông số này là các yếu tố quan trọng cần chú ý khi điều chỉnh. Hình 5 mô tả một kết quả đếm một mẫu tế bào, tỉ lệ tế bào sống chết giữa trước (hình 5A) và sau khi điều chỉnh các thông số (hình 5B) thay đổi rất lớn do máy đếm tế bào Countess 3 FL bỏ qua các mảnh vỡ tế bào không mong muốn trong quá trình phân tích

Hình 5: Kết quả đếm trước khi điều chỉnh thông số (A), và sau khi điều chỉnh (B)

3. Độ sáng và cường độ huỳnh quang: sử dụng thông số huỳnh quang gia tăng sự linh động của máy đếm tế bào tự động Countess 3 FL. Trong một số trường hợp, sử dụng một nguồn đèn huỳnh quang, người dùng dễ dàng xác định nhanh bao nhiêu tế bào phát một loại tín hiệu huỳnh quang như trong các thí nghiệm chuyển gene (hình 6A). Mặc khác, với 2 nguồn huỳnh quang người dùng dễ dàng theo dõi nhiều đặc tính của quần thể tế bào cùng lúc. Đặc biệt, máy đếm tế bào tự động Countess 3 FL cho phép điều chỉnh độc lập các thông số độ tròn của tế bào, kích thước (cell size), độ sáng và cường độ huỳnh quang ở từng kênh màu, tạo điều kiện cho người dùng tạo nên các bộ thông số phân tích rất chi tiết (hình 6B). Các thông số này dễ dàng được lưu trữ trong máy và áp dụng vào những lần đếm sau.

Hình 6: Đếm quần thể tế bào phát tín hiệu huỳnh quang TxRed (A), đếm các quần thể tế bào phát tín hiệu trên 2 kênh GFP và TxRed (B)

Kết luận

Sự biến động trong kết quả đếm tế bào có nhiều nguyên nhân bao gồm chuẩn bị mẫu, chọn mặt phẳng tiêu cự, chế độ ánh sáng và chiến lược thiết lập thông số đều ảnh hưởng đáng kế đến kết quả. Một máy đếm tế bào tự động có khả năng lấy nét tự động, điều chỉnh cường độ sáng tự động và linh hoạt tối đa thiết lập thông số như Countess II FL tạo nên kết quả đếm tế bào hoàn toàn đáng tin cậy. Khả năng lưu trữ các thông số và sử dụng nhất quán các thông số đã được thiết lập trên các mẫu có thể giúp cải thiện độ chính xác của kết quả.

--------------------------------------------

CÔNG TY TNHH PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VITECH

Hotline: 024.3783.5922 | 028.3517.0468

www.vitechltd.vn | www.vitechshop.vn

VP HÀ NỘI: Số 6 Lô 1D Khu Đô thị Trung Yên Trung Hòa, Cầu Giấy, Hà Nội

VP HỒ CHÍ MINH: Số 5 đường 13 KDC Miếu Nổi, Phường 3, Quận Bình Thạnh, TP. HCM